SeroKrystal™PDL微孔板在无血清条件下提升细胞活力、形态及增殖能力

作者： Ewa Wosiek，项目支持科学家  & Dr. Lindsay Parkes，高级项目科学家，Porvair Sciences Ltd.

关键词：poly-d-lysine 聚D-赖氨酸，PDL、 krystal,、serum-free 无血清、细胞培养、Sero

摘要

研究人员在无血清环境下培养细胞，以更准确地模拟生理条件。然而，在无血清条件下，许多细胞系难以附着于组织培养塑料表面，从而给细胞培养带来挑战。本应用说明展示了 Sero Krystal™ 聚-D-赖氨酸（PDL）涂层微孔板如何克服这些问题，在无血清培养基中促进细胞更好的附着、生长和增殖，特别适用于较难培养的细胞类型。

引言

细胞培养和分析技术正在快速发展，高通量筛选（HTS）的需求不断增长，特别是在药物筛选和发现等大规模应用中。近年来，多种基于细胞的 HTS 方法被用于开发潜在的抗冠状病毒治疗方案，以筛选能够抑制 SARS-CoV-2 复制的广谱抗病物。在使用贴壁细胞系的实验中，科学家通常会考虑在细胞培养基中补充胎牛血清（FBS）等动物来源的血清，以帮助细胞附着在培养器皿的塑料表面。

尽管血清有助于细胞生长，但其应用也存在诸多风险，包括污染、环境与伦理问题、成本及供应稳定性等。此外，批次间差异性也是传统培养方式的一大挑战。对于贴壁细胞而言，能够牢固地附着于培养基质表面是其增殖和分化的关键前提。Sero Krystal™ PDL 涂层微孔板为此提供了理想的解决方案，无需使用动物来源血清，即可确保细胞的附着、存活及增殖能力。

图 1. 聚赖氨酸分子结构示意图。赖氨酸是一种氨基酸，有两种对映体，即 L-赖氨酸和 D-赖氨酸

赖氨酸是一种氨基酸，存在两种对映异构体：L-赖氨酸（L-Lysine）和 D-赖氨酸（D-Lysine）。聚赖氨酸（Poly-Lysine, PL）是一种常用于组织培养器皿表面涂层的合成蛋白聚合物，能够支持贴壁细胞系的生长、附着和分化。PDL 由于带正电荷且能抵抗某些细胞分泌的蛋白酶降解，因此相比 PLL 更受青睐（Wiatrak, 2020）。此外，PDL 作为人工合成蛋白，不会影响细胞的信号通路，因此广泛应用于细胞培养系统。

Sero Krystal™ PDL 涂层微孔板提供 96 孔和 384 孔两种规格，其表面采用分子量在 70~150 kDa 之间的 PDL 聚合物进行涂层处理，使微孔板表面形成均匀的正电荷。这种正电荷表面可增强与细胞膜负电荷之间的静电相互作用（Curtis, 1983），从而提高细胞附着能力。

Sero Krystal™ PDL 微孔板特别适用于转染细胞系、原代神经元、神经胶质细胞及成纤维细胞的培养。例如粘附性小鼠成纤维细胞系L929和其他常见粘附性细胞系，包括HEK-293、BHK-21、PC12和NSC-34.

L929 细胞系是一种来源于 C3H/An 雄性小鼠皮下疏松结缔组织的成纤维细胞株（Heap,  2021）。该细胞系常被研究人员用于病毒转染及疫苗性能研究，并被视为细胞毒性测试的“金标准"（Dumitra?cu,  2022）。因此，本研究选用 L929成纤维细胞系进行试验。在选定的 PDL涂层或未涂层表面，使用无血清的  Dulbecco  改良 Eagle 培养基（DMEM）培养 L929 细胞，并评估其形态、活性和生长情况。

实验将组织培养处理（TC）未涂层96孔聚苯乙烯（PS）表面与 Sero Krystal™  PDL 涂层微孔板的实验结果进行比较。同时，L929 细胞在这两种表面上的形态及生长数据还与以未涂层 TC 表面并补充血清培养基为对照组的数据进行比较分析。

材料与方法

L929 细胞培养

冷冻的 AATC L929 细胞（Sigma, UK）解冻后，接种于 DMEM（Lonza,  Belgium）培养基中，并补充 2 mM 谷氨酰胺（Lonza,  UK）、1% 青霉素/链霉素（Sigma, UK）和 10% FBS（HyClone,  South America），于 37°C、5% CO? 环境下培养，每 48 小时传代一次。

PDL板选择

本研究使用了 Sero Krystal™ 透明 96 孔 PDL 涂层微孔板（Porvair Sciences, 英国，产品编号500269-PDL）。作为对照，选择了 Sero™ Krystal™ 未涂层透明 96 孔组织培养（TC）处理板（Porvair Sciences, 英国，产品编号500269-TC）。

铺板接种

在 75 cm2培养瓶中培养贴壁 L929细胞，使其在含有胎牛血清（FBS,  HyClone, 南美）、1%青霉素/链霉素（Sigma, 英国）和 2mM 谷氨酰胺（Lonza, 英国）的培养基中生长至汇合。然后使用 0.25% 胰蛋白酶/EDTA（Sigma, 英国）进行消化。经过37°C消化 5 分钟后，细胞从培养瓶表面脱落，随后加入10 ml含10% FBS的 DMEM培养基终止胰蛋白酶消化。L929 细胞悬液转移至15 ml离心管中，以1,200 rpm离心 5分钟收集细胞沉淀。弃去上清液，并加入10 ml无血清 DMEM培养基轻柔混匀，以形成单细胞悬液。使用台盼蓝（Biorad, 英国）染色法，并借助细胞计数载玻片及TC20全自动细胞计数仪（Biorad, 英国）进行细胞计数，遵循制造商说明操作。随后，将50,000个细胞悬浮于100 µl 无血清 DMEM（Lonza, 比利时）中，该培养基补充有2mM谷氨酰胺及 1%青霉素/链霉素（Sigma, 英国），并将其接种至所选微孔板的每个孔中。细胞在37°C、5% CO?的培养条件下孵育24小时。

形态学测试

在所选微孔板的含血清及无血清DMEM（Lonza，比利时）培养条件下孵育24小时后，使用倒置光学显微镜观察L929细胞，并使用ZOE荧光细胞成像仪（Biorad, 英国）拍摄图像，以评估细胞的形态、生长和贴壁情况。每块微孔板至少观察10个孔，以确保所得图像具有代表性。

细胞活力测试

在无血清培养基中孵育24小时后，从每块微孔板随机选取孔进行细胞计数及活力测试。细胞活力测定采用台盼蓝染色法，并使用细胞计数载玻片及 TC20 全自动细胞计数仪进行检测，具体操作与前述方法相同。在测定前，先去除选定孔中的培养基，并用100 µl预温PBS（Lonza, 英国）清洗细胞。然后使用 50 µl  0.25% 胰蛋白酶/EDTA溶液（Sigma, 英国）消化细胞，并向每个孔中加入50 µl PBS（Lonza, 英国）使总体积达到 100 µl。通过轻柔吹打使细胞形成单细胞悬液，并从12个孔中记录细胞数及细胞存活率，最终计算平均值。

结果与讨论

为了验证 Sero Krystal™ PDL 微孔板在无血清条件下促进细胞粘附、增强增殖及提高存活率的性能，我们在标准组织培养处理（TC-treated）微孔板和 Sero Krystal™  PDL 涂层微孔板上培养了 L929 细胞。

如 图 2A 所示，在无血清条件下生长的 L929 细胞在未经涂层处理的 TC 处理塑料表面上表现出细胞聚集和较差的细胞粘附性。细胞形态不规则，仅零星地附着在微孔板孔的表面，且细胞密度较低，形成了分化不良的细胞聚集体。相比之下，在Sero Krystal™ PDL 微孔板 上，细胞实现了完整融合，形态规则且分化良好。L929 细胞均匀分布在微孔板均匀涂层的孔表面（图 2B）。在 Sero Krystal™ PDL 微孔板 上，无血清条件下 L929 细胞的融合度和粘附性与在 补充血清培养基 条件下 未涂层 TC 处理塑料表面 上的细胞生长情况相当（图 2C）。这意味着 Sero Krystal™ PDL 微孔板能够避免动物血清相关的污染风险、环境及伦理问题，同时降低成本，并消除批次间差异带来的不确定性。

图 2.  在无血清 DMEM 培养基中培养的 L929 细胞生长情况：（A）TC 处理表面；（B）Porvair Sciences Sero Krystal™ PDL 涂层微孔板；（C）补充 FBS 的 DMEM 培养基中 TC 处理表面。

细胞计数及存活率测定（见 表 1）表明，在 24 小时培养后，Sero Krystal™ PDL 涂层微孔板上的 存活细胞数最高。这些数据清楚地表明，在无血清条件下，Sero Krystal™ PDL 涂层表面为贴壁生长的 L929 细胞提供了 最佳的存活环境。在 Sero Krystal™  PDL 微孔板上培养的L929 细胞，其存活率提高了 约 50%。

表 1. 未涂层 TC 处理微孔板与 Sero Krystal™ PDL 涂层微孔板的细胞计数和细胞活力读数。

结论

本应用说明突出了光学透明 96 孔 Sero Krystal™ PDL 微孔板在无血清或低血清条件下的性能。贴壁细胞系 L929 在该微孔板上表现出增强的细胞附着性、均一的细胞形态以及加速的生长和增殖。结果表明，Sero Krystal™ PDL 涂层微孔板系列是无动物成分的理想替代方案，可在无血清环境下实现安全、高效的贴壁细胞粘附。

Sero Krystal™ PDL 微孔板提供多种孔板格式，适用于高通量筛选，同时具备不同的框架颜色，以适配各类检测系统，并通过最小化串扰提升光度检测结果。

参考

1. Curtis, A.,  Forrester, J., McInnes, C. and Lawrie, F.,  1983. Adhesionof cells to polystyrene surfaces. Journal of Cell Biology, 97(5), pp.1500-1506.

2. Dumitra?cu, A.,  Cara?,  I.,  ?ucureanu,  C., Ermeneanu,  A.  and  Tofan, V.,  2022.  Nickel  (II)  and  Cobalt  (II)  Alginate Biopolymers as a “Carryand Release" Platform for Polyhistidine-Tagged Proteins. Gels, 8(2), p.66.

3. Heap, R., Marín-Rubio,J.,Peltier, J., Heunis,T., Dannoura, A., Moore, A. and Trost, M., 2021. Proteomics characterisation of the L929 cell supernatant andits role in BMDM differentiation. Life Science Alliance, 4(6), p.e202000957.

4. Wiatrak, B., Kubis-Kubiak,

A., Piwowar, A. and Barg, E., 2020. PC12 Cell Line: Cell Types, Coating of Culture Vessels, Differentiation and Other Culture Conditions. Cells, 9(4), p.958.